试验研，机械破碎法分离奶牛乳腺上皮细胞的体外培养研宄林桂娟。王恬。阵寸勇南京农业大学动物科学院，江苏南京210095外培养的效果。培养液由DMEMF12加20小牛血清组成培养条件为5CO237C.机械破碎法分离的细胞在培养2d开始生长增殖，7d基本长满培养板底部；而培养的乳腺组织块细胞到5 4后才呈现旺盛生长，长满培养板底部需1415，结果明，机械破碎法是分离乳腺上皮细胞的种有效方法。
细胞的分离与培养是细胞生物学和细胞工程学的必需技米它被广泛应用于分子生物学基因工程学和药理学等方面胞培养成功的报道还很少，且多为大鼠对牛乳腺上皮细胞培养的效果都不理想1561.
酶消化法和机械破碎法是分离细胞的2种常用方法。酶消化法通过蛋白酶胶原酶等消化组织。获得相应的细胞，这种方法在肝细胞。心肌细胞等的培养中应用非常广泛7+8；但用胶原酶消化水牛乳腺组织进行细胞培养。并未培养出乳腺上皮细胞6.近年来，机械破碎法分离细胞逐渐被重视。愧春娟等1997用机械破碎法成功地培养了分离的小鼠脾细胞9.陈晓宇等2003则得到了比用其他方法更多的卵母细胞。
但目前还未用机械破碎法来分离奶牛乳腺上皮细胞的报道本试验旨在探索用机械破碎法分离奶牛乳腺上皮细胞并进行了体外培养验证。
1材料与方法1.1主要仪器和试剂倒置显微镜叶，叫日本。肘，15人型2培养箱SANY0，日本。高速低温离心机8肘！队德国。mn.MFdSr1tllyolnne.笑15.新生小牛血清；犯。美国。病岛素。氢化1的松。孕圃；水醋酸等。均为国产试剂。
1.2培养液配制1以下2培养液和新生+牛血沾分别经122微孔滤膜过滤除菌，41存放。使用前在培养液中添加20小牛血清胰岛素5氢化可的松孕酮1 1.3鼠尾胶原制备基金项目农业部重大技术研宄专项2000903，满概抱。版3入。6咖36也0此，如1版痛蒙，在替1激私。蜃料，剥去皮毛，抽出尾键，剪碎！放入，1冰醋酸溶液中。48后低温离心。清液即为鼠尾胶原。将制备好的胶原均匀铺于6孔培养板上晾干备用，1.4机械破碎法分离乳腺上皮细胞按常规程序消毒奶牛乳房，切取乳腺组织块。置于预先加有80似青霉素100似链霉素的37生理盐水中迅速带回实验室。在超净工作台上，用灭菌后的88液洗去乳汁血污，在含有少量培养液的青霉素小瓶中，用眼科剪反复剪切乳腺组织至糊状。然后将组织碎块连同培养液倒入离心管中再补加少许培令麻吸符吹打片刻睁吸除上层脂肪和纤维含量多的碎块。再补加培养液进行吹打，如此重复3次。末次吹打后。立即通过4层无菌纱布过滤入小烧杯中。用无菌牛皮纸封口。置于37的2培养箱中静置2取出烧杯轻轻振荡。将未贴壁的细胞移入另个烧杯中。
取1滴液样在细胞记数板上测定细胞密度。然后将细胞密度调整到106个1.5体外培养1.5.1细胞培养铺好鼠尾胶原的培养板紫外线消毒2将制好的细胞悬液接种到培养板上，置于，2培养箱中370培养。3后第1次换液，以后隔天换液1次，细胞长满培养板悬液传代。
1.5.2组织块培养按上述方法洗净乳腺组织后，用手术刀把块切成约3的小块。用滴管将出。织块接种在厌有胶原的培养板上，每小块之间的距离为0.5迎左右。在每个组织块上加1滴培养液。置于37，的2培养箱中贴壁4 1然后加适量培养液。放回培养箱中培养。从第6天开始，隔天换液1次。待细胞长满培养板的8090后去除组织块，用胰蛋白酶消化培养板上的细胞。用培养液制成细胞悬液传代。
所有培养的细胞和组织每天观察12次。
2结果2.1机械破碎法分离乳腺上皮细胞的形态与生长2.1.1细胞形态观察用于接种的细胞悬液，在显微镜下可大量乳腺上皮细胞个别体积较大的成纤维细胞和脂肪细胞。培养2，1后低倍显微镜下观察，各乳腺细胞大小致呈小圆点状；成纤维细胞和脂肪细胞消失。高倍显微镜下观察，细胞总休圆形。细胞膜1苜不则的小突起。细胞核也呈圆形。未有卵圆形的细胞核。
2.1.2细胞生长培养21后。乳腺上皮细胞开始分裂增殖，培养板上出现少量未分散的细胞团；到41时细胞数量明显，多。细胞密度明显变大。61时局部细胞连成小块，细胞之间连接紧密；71时。细胞基本连接成片，并且长满了培养板底部。细胞之间没有间隙。
2.2组织块培养法乳腺上皮细胞的形态及生长乳腺组织块培养3，1后，有少量细胞从组织块边缘分生出来。铺展在胶原面。细胞间连接很少。高倍显微镜下观察，时，组织块周围出现细胞晕圈，细胞朝定方向生长，即有旋润状走势。71时细胞圈出现明显分区以组织块为中心，内圈细胞明亮细胞间连接紧密，明亮的晕圈外周有暗色细圈。第10天组织块周围的细胞，进步扩大。暗色细圈消失。培养151时，部分邻近细胞圈相连，有些细胞，边缘或中间出现细胞堆积现象。
3讨论据报道。酶消化法可分离许多细胞。但它可能不适用于乳腺上皮细胞的分离。郑玉才1994用胶原酶消化水牛乳腺组织进疔细胞培养。没有获得乳腺上皮细胞1夂本实验室也尝试用胶原酶消化奶牛乳腺组织。亦未获得正常生长的乳腺上皮细胞。其原因可能是酶消化液会损伤乳腺上皮细胞。从而影响其正常的生长，殖。本试验结果明机械破碎法可用于分离奶牛的乳腺上皮细胞。该方法不仅操作方便细胞得率高，而且不影响乳腺细胞的活力，易于将其收集并进行体外培养。机械破碎法分离的乳腺上皮细胞培养后，细胞生长和，殖迅速，细胞形态规整。可用于各种体外研究。与组织块培养法相比。
机械破碎法显著缩短了乳腺上皮细胞培养时间。并减少了杂质细胞。
成纤维细胞脂肪细胞等其他细胞的干扰是影响乳腺上皮细胞培养的个主要因素，体外培养中可采取3个措施来减少这种干扰①在制备细胞悬液时反复吸除上层液体，除去脂肪小碎块等杂质，这样可除去大量非目的细胞。从而有助于获得较纯的乳腺上皮细胞。赵连友等2003报道，将细胞悬液，置培养6，9即可分离出成纤维细胞1本实验采用差速贴壁法进行了预培养。静置时间延长至2去除成纤维细胞的效率很高。性激素对乳腺的生长发育有重要的调节作用。研宄明性激素能刺激体外培养的乳腺上皮细胞持续生长乳腺上皮细胞的旺盛生长会抑制其他细胞的增殖，使培养的目的细胞更纯，本实验的各处理培养基中均添加了孕酮促进了乳腺上皮细胞生长，抑制了成纤维细胞生长。
组织块培养时观察到的细胞晕外层的暗圈可能就是受到抑制而死的成纤维细胞，皮细胞和间充质之间的关系十分密切，其生长和分化的因子主要来源于间充质3.在动物机体内。上皮细胞位于基膜面。基膜含有大量的胶原蛋白附着蛋白和氨基多糖；在体外培养时。上皮细胞和间充质之间的依存关系仍然存在。
研宄明。胶原可促进体外培养的乳腺组织块和上皮细胞的附着和生长。李震等2000用未铺胶原的培养瓶培养乳腺上皮细胞，结果细胞很难贴壁5.除此之外。激素和生长因子也可调节原代细胞的，殖和分化叭在培养基中添加胰岛素和蓖；化可的松可促进细胞的贴壁和伸展，本试验中应用这些激素可能是促成乳腺上皮细胞成功培养的个因素。
副猪嗜血杆菌的分离与鉴定尹秀凤，姜平邓雨修，汤景元南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095菌，兼性厌氧。生化试验为接触酶阳性，氧化酶阴性，鸟氨酸脱羧酶吲哚和脲酶阴性；生长需要发酵果糖半乳糖葡萄糖和蔗糖；不分解0甘露醇山梨醇和海藻糖，用副猪嗜血杆菌的163小亚单位1和基因的特异性1尺引物，通过，1技术分别从该分离菌株扩增出822及1.9以的特异基因片段，明该分离菌株为副猪嗜血杆菌。
收稿日期200406年教师资助计划。
基金项目浙江省科技攻关项目0202529国家自然科学基作者简介尹秀凤197，女，硕士。
金30270990江苏省高新技术项目32002317和教育部优秀青通讯作者。
李震，王英刘惠莉，等。牛乳腺上皮细胞的分离培养。上海农业学报，20001632528.
郑玉才。水牛乳腺上皮细胞的体外培养。西南民族学院学张立国，潘继给，李结良。等。果糖修饰壳聚糖微载体的制备9倪春娟，苗聪秀，张联珠小鼠脾细胞培养制备染色体及组型m陈晓宇，刘东，李青旺，等。不同收集方法对猪卵母细胞体外成熟培养的影响。上海畜牧兽医通讯，2003，薛庆善，体外培养的原理与技术1.北京科学出版社，2001.
赵连友，陈永清，田建伟，等。蛋白激酶抑制剂对精氨酸升压素调控心脏成纤维细胞增殖及27蛋白达的影响1.中华医学杂志，2003，835421424.
69. 15鄂征。组织培养和分子细胞学技术以。北京北京出版